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關(guān)于細胞轉(zhuǎn)染,你知道多少

原載自:m.xrpalvh.cn[行情動態(tài)]  2018-01-29  瀏覽次數(shù):5590

細胞轉(zhuǎn)染定義:將外源分子如DNA RNA等導(dǎo)入真核細胞的技術(shù)。

瞬時轉(zhuǎn)染:外源DNA/RNA不整合到宿主染色體中,因此一個宿主細胞可存在多個拷貝數(shù),產(chǎn)生高水平的表達,但通常只持續(xù)幾天,多用于啟動子和其他調(diào)控元件的分析。一般來說,超螺旋質(zhì)粒DNA轉(zhuǎn)染效率較高,在轉(zhuǎn)染后24-72h內(nèi)分析結(jié)果,常常用到一些報告系統(tǒng)如熒光蛋白,β半乳糖苷酶等來幫助檢測。

穩(wěn)定轉(zhuǎn)染:外源DNA既可以整合到宿主染色體中,也可能作為一種游離體存在。盡管線性DNA比超螺旋DNA轉(zhuǎn)入量低但整合率高。外源DNA整合到染色體中概率很小,通常需要一些選擇性標(biāo)記反復(fù)篩選得到穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的同源細胞系。

方法及特點:

化學(xué)法:磷酸鈣法、DEAE-右旋糖苷法、陽離子脂質(zhì)體法

物理法:電穿孔法、顯微注射法、biolistic顆粒傳遞法

病毒介導(dǎo)法:逆轉(zhuǎn)錄病毒、腺病毒

陽離子脂質(zhì)體法:帶正電的脂質(zhì)體與核酸帶負電的磷酸基團形成復(fù)合物被細胞內(nèi)吞。過程如下圖:

特點:簡單通用,適用性廣,轉(zhuǎn)染效率高,重復(fù)性好,但轉(zhuǎn)染時需除血清,轉(zhuǎn)染效率隨細胞類型變化大。

脂質(zhì)體法由于脂質(zhì)體復(fù)合物與貼壁細胞的接觸機會遠大于懸浮細胞,所以貼壁比懸浮轉(zhuǎn)染效率要高。懸浮細胞建議使用電穿孔法。

電穿孔法:利用高壓電脈沖對細胞膜的干擾,使其形成利于核酸進入的微孔。

特點:需要特定儀器,適用性廣,除了質(zhì)粒外,還可轉(zhuǎn)染大的基因組,細胞致死率高。

逆轉(zhuǎn)錄病毒(RNA):通過病毒中膜糖蛋白和宿主細胞表面的受體相互作用進入宿主細胞,之后反轉(zhuǎn)錄酶啟動合成DNA并隨機整合到宿主基因組中。

特點:穩(wěn)定轉(zhuǎn)染,可用于難轉(zhuǎn)染的細胞、原代細胞,體內(nèi)細胞等,但攜帶基因不能太大。

腺病毒(雙鏈DNA):先和細胞表面的受體結(jié)合,繼而在αV整合素介導(dǎo)下被細胞內(nèi)吞。

特點:可用于難轉(zhuǎn)染的細胞。

                                                              

 轉(zhuǎn)染步驟:DAY-1  鋪板

                 DAY 0  DNA分子與復(fù)合物混合,轉(zhuǎn)染細胞

                 After  監(jiān)測轉(zhuǎn)染水平                                                                       

影響轉(zhuǎn)染的因素:

1、血清  血清影響復(fù)合物的形成,降低轉(zhuǎn)染效率

陽離子脂質(zhì)體和DNA的*量在使用血清時會有所不同,因此想在轉(zhuǎn)染培養(yǎng)基中加入血清時要進行條件優(yōu)化。大部分細胞可以在無血清培養(yǎng)基中幾個小時內(nèi)保持健康,對于對血清缺乏比較敏感的細胞,可以使用OPTI-MEM I培養(yǎng)基。對于對血清缺乏比較敏感的貼壁細胞,建議使用LIPOFECTAMINE 2000

2、抗生素  比如青霉素和鏈霉素,是影響轉(zhuǎn)染的培養(yǎng)基添加物。這些抗生素一般對于真核細胞無毒,但陽離子脂質(zhì)體試劑增加了細胞的通透性,使抗生素可以進入細胞。這降低了細胞的活性,導(dǎo)致轉(zhuǎn)染效率低。

3、細胞代數(shù)  轉(zhuǎn)染前細胞經(jīng)過1-2次傳代保證細胞生長旺盛容易轉(zhuǎn)染,注意貼壁細胞一旦長滿就不好轉(zhuǎn)染。

4、細胞鋪板密度  一般轉(zhuǎn)染時,貼壁細胞密度為70%-90%,懸浮細胞密度為2*10^6--4*10^6細胞/ml時效果較好。確保轉(zhuǎn)染時細胞沒有長滿或處于靜止期。鋪板細胞數(shù)目的增加可以增加轉(zhuǎn)染活性和細胞產(chǎn)量。

5、DNA質(zhì)量  DNA質(zhì)量對轉(zhuǎn)染效率影響非常大。一般的轉(zhuǎn)染技術(shù)基于電荷吸引原理,如果DNA不純,如帶少量的鹽離子,蛋白,代謝物污染都會顯著影響轉(zhuǎn)染復(fù)合物的有效形成和轉(zhuǎn)染的進行。

 

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